研究現場で即座に利用可能な組織培養実験の標準的技術マニュアル。

【目 次】
序　説

第1章　細胞培養実験に必要な設備，器具，試薬と基礎知識
　1.1　細胞培養実験に必要な設備・機器
　　1.1.1　実験施設
　　1.1.2　培養実験に必要な機器・装置
　　1.1.3　細胞・試薬保管設備
　1.2　細胞培養実験に利用される器具類
　　1.2.1　ガラス器具
　　1.2.2　プラスチック製器具
　　1.2.3　その他の器具・機器
　　1.2.4　実験器具類の洗浄法と滅菌法
　　1.2.5　本書の実験全体を通じて必要な器具類
　1.3　組織培養実験に利用される培地および試薬溶液
　　1.3.1　細胞培養に用いられる溶媒
　　1.3.2　基礎培地
　　1.3.3　添加物
　　1.3.4　培地類調製・滅菌と試験
　　1.3.5　細胞分散液などその他の溶液の調製と滅菌
　1.4　細胞の入手および管理・維持
　　1.4.1　細胞情報の入手
　　1.4.2　細胞の入手
　　1.4.3　細胞の管理と維持
　　1.4.4　細胞の輸送
　1.5　細胞の品質管理
　　1.5.1　細胞の品質に影響を与える因子
　　1.5.2　細胞品質に影響を与える異物の混入
　　1.5.3　細胞品質に影響を与える細胞性状
　　1.5.4　細胞ロット管理の考え方
　1.6　培養実験の安全管理とバイオハザード対策
　　1.6.1　培養作業および実験上の注意事項
　　1.6.2　バイオハザード対策

第2章　基本的手技
　2.1　無菌操作手技
　　2.1.1　無菌操作とは
　　2.1.2　細胞分散法
　　2.1.3　細胞の継代
　　2.1.4　細胞凍結保存法
　　2.1.5　凍結細胞の解凍と再培養
　　2.1.6　まとめ
　2.2　細胞の計数
　　2.2.1　細胞の計数法
　　2.2.2　継代数と集団倍加数
　　2.2.3　細胞倍加時間と細胞増殖曲線
　2.3　細胞増殖に基づいた培養細胞アッセイ法の基礎
　　2.3.1　細胞増殖曲線の作成法
　　2.3.2　用量作用曲線の作成法
　2.4　無血清培養
　　2.4.1　無血清培地と血清
　　2.4.2　無血清培地の使用
　2.5　クローニング
　　2.5.1　クローニング
　　2.5.2　セルソーター
　2.6　形態観察法
　　2.6.1　位相差顕微鏡による形態観察
　　2.6.2　観察の手法
　　2.6.3　タイムラプス解析
　2.7　遺伝的解析法（核型解析）
　　2.7.1　染色体と核型
　　2.7.2　染色体異常
　　2.7.3　in vitro染色体異常試験
　　2.7.4　染色体標本の作製
　　2.7.5　核型解析（染色体検査）
　2.8　微生物による汚染の検出
　　2.8.1　細菌・酵母・真菌
　　2.8.2　マイコプラズマ
　　2.8.3　ウイルス
　2.9　培養細胞の識別法
　　2.9.1　ヒト由来細胞の識別方法
　　2.9.2　動物由来細胞の識別方法（ヒト由来細胞以外）
　　2.9.3　まとめ

第3章　初代培養法
　3.1　生物検体からの初代培養
　　3.1.1　ヒト皮膚由来線維芽細胞の樹立
　　3.1.2　ヒト間葉系幹細胞（1）─骨髄由来間葉系幹細胞の樹立
　　3.1.3　ヒト間葉系幹細胞（2）─歯髄由来間葉系細胞の樹立
　　3.1.4　ヒト間葉系幹細胞（3）─羊膜由来間葉系幹細胞の樹立
　　3.1.5　マウス胎仔線維芽細胞の樹立
　　3.1.6　マウス（ラット）骨髄間葉系幹細胞
　　3.1.7　正常細胞の分裂寿命と細胞老化
　3.2　株細胞の樹立
　　3.2.1　ヒト上皮細胞株からの不死化細胞株の樹立
　　3.2.2　iPS細胞からの赤血球前駆細胞株の樹立

第4章　3次元培養法─オルガノイド培養と大量培養の基本手技
　4.1　細胞挙動を制御する培養担体
　　4.1.1　培養担体と培養容器の関係
　　4.1.2　培養担体の設計概念
　　4.1.3　オルガノイド構築用の培養担体と培養法
　　4.1.4　細胞の大量増殖用の培養担体と培養法
　4.2　ゲル培養法1：コラーゲンゲル培養法
　　4.2.1　コラーゲンゲルを用いた基本的な3次元培養
　　4.2.2　組織片培養
　　4.2.3　流体刺激培養
　　4.2.4　気相―液相（空気曝露）培養
　4.3　ゲル培養法2：コラーゲンビトリゲル膜培養法
　　4.3.1　剥離可能なCVMを付着した培養ディッシュ
　　4.3.2　CVMを備えたチャンバー
　　4.3.3　CVMを備えた細胞封入デバイス
　4.4　ゲル培養法3：マトリゲル培養法
　　4.4.1　マトリゲル
　　4.4.2　マトリゲルを用いたサンドイッチ培養法153
　　4.4.3　サンドイッチ培養法が肝細胞機能に与える影響
　　4.4.4　サンドイッチ培養肝細胞を用いた薬物による排泄トランスポーターの阻害能評価
　　4.4.5　サンドイッチ培養肝細胞を用いた胆汁酸依存的な肝毒性評価法構築
　4.5　ゲル培養法4：アルギン酸ゲル培養法
　　4.5.1　アルギン酸ゲルとは
　　4.5.2　アルギン酸ゲルでの細胞包埋
　　4.5.3　アルギン酸ゲル内での培養の問題点
　　4.5.4　アルギン酸ゲルでの3 次元構築：3Dバイオプリンターの開発
　　4.5.5　バイオインクとしてのアルギン酸ゲル
　　4.5.6　アルギン酸ゲルの問題点への対応
　　4.5.7　生体材料工学研究の問題点
　　4.5.8　アルギン酸ゲルの細胞組織培養用のモールド（鋳型）への応用
　　4.5.9　まとめ
　4.6　スフェロイド培養法
　　4.6.1　スフェロイドとは
　　4.6.2　スフェロイドの種類
　　4.6.3　スフェロイドの生理学・構造学的特徴
　　4.6.4　スフェロイドの形成と培養
　　4.6.5　スフェロイド培養のアプリケーション
　4.7　ヘテロスフェロイド培養法
　　4.7.1　ヘテロスフェロイドとは
　　4.7.2　ヘテロスフェロイドの例
　　4.7.3　MC培地への細胞懸濁液の吐出
　　4.7.4　MC培地を使った培養
　　4.7.5　MC培地からの回収方法
　　4.7.6　ヘテロスフェロイドの観察・分析方法
　　4.7.7　ヘテロスフェロイドの展望
　4.8　マイクロ流路培養法（MPS）
　　4.8.1　MPSとは
　　4.8.2　MPSの技術的背景
　　4.8.3　MPS技術の現状
　　4.8.4　その他のMPS技術の可能性
　　4.8.5　MPSの今後
　4.9　脱細胞化組織を利用した培養法
　　4.9.1　脱細胞化組織の取得法
　　4.9.2　脱細胞化臓器を鋳型とした培養法
　　4.9.3　脱細胞化組織抽出基材を利用した培養法
　　4.9.4　まとめ
　4.10　生分解性ポリマーを利用した培養法
　　4.10.1　ポリl乳酸（PLLA）の多孔質担体作製
　　4.10.2　ディスク状のPLLA多孔質担体の前処理
　　4.10.3　ディスク状のPLLA多孔質担体を用いた3次元培養
　4.11　酸素供給培養法1：酸素透過プレート培養法
　　4.11.1　酸素透過プレート培養法の概要
　　4.11.2　培養底面からの酸素供給の特徴
　　4.11.3　培養プレートの準備
　　4.11.4　酸素透過性材料の表面改質
　　4.11.5　使用・適用例
　　4.11.6　曝露酸素濃度評価法
　　4.11.7　諸注意・課題と問題点
　4.12　酸素供給培養法2：ベセル培養法
　　4.12.1　ベセル培養器
　　4.12.2　細胞培養スキャフォールド材としての特徴
　　4.12.3　酸素供給培養としての特徴
　　4.12.4　培養環境の生体模倣
　4.13　大量培養法1：ホローファイバー培養法
　　4.13.1　ホローファイバー培養法
　　4.13.2　抗体・GM.CSFなどのタンパク質生産
　　4.13.3　ウイルス・細胞外小胞生産
　　4.13.4　間葉系幹細胞・造血幹細胞・iPS細胞などの生産
　　4.13.5　人工臓器・臓器シミュレーター
　4.14　大量培養法2：多孔質培養法
　　4.14.1　大量培養技術の必要性
　　4.14.2　多孔質培養法における細胞計数と培地成分消費
　　4.14.3　多孔質担体培養法（例：Cytopore）
　　4.14.4　多孔質担体培養法（例：Fibra.Cel）
　　4.14.5　多孔質スキャフォールド培養法（例：Cellbed）
　4.15　大量培養法3：攪拌培養法
　　4.15.1　攪拌培養法
　　4.15.2　大量培養における攪拌懸濁培養法の分類
　　4.15.3　攪拌培養槽の設計
　　4.15.4　酸素供給について
　　4.15.5　攪拌の方法
　　4.15.6　攪拌槽型培養における種々の操作

第II部　活用編
第5章　がん細胞培養法
　5.1　患者手術材料の扱い方
　　5.1.1　がん研究におけるヒト手術材料の重要性
　　5.1.2　HeLa細胞の歴史と医療倫理
　　5.1.3　倫理申請
　　5.1.4　患者手術材料の取り扱い
　　5.1.5　培養細胞株から得られるデータの解釈
　5.2　患者手術材料からの培養
　　5.2.1　付着性がん細胞株の樹立
　　5.2.2　腫瘍組織片からのがん細胞株樹立法
　　5.2.3　胸水・腹水からのがん細胞株樹立法
　　5.2.4　がん細胞の識別および選択方法
　　5.2.5　がん細胞の鑑別
　　5.2.6　使用した器具の滅菌，廃棄
　　5.2.7　白血病幹細胞の初代培養
　5.3　がん細胞培養株の継代方法
　　5.3.1　がん細胞とは
　　5.3.2　がん細胞のゲノム
　　5.3.3　がん細胞株を使用した治療法開発の研究
　　5.3.4　がん細胞株を使用した実験の注意点
　　5.3.5　がん細胞株の継代の注意点
　5.4　前がん病変（大腸腺腫）からの培養
　　5.4.1　大腸の前がん病変とは
　　5.4.2　大腸前がん病変を用いたオルガノイド培養
　　5.4.3　大腸前がん病変のオルガノイド培養の現状と展望
　5.5　CTOSとPDXのシャトルシステム
　　5.5.1　ヒトがんモデル
　　5.5.2　患者腫瘍の異種移植（patient.derived xenograft，PDX）法
　　5.5.3　初代3 次元がん細胞培養（cancer tissueoriginated spheroid，CTOS）法
　　5.5.4　CTOSとPDXのシャトルシステム
　　5.5.5　今後の展望
　5.6　がん免疫
　　5.6.1　多能性幹細胞からのT細胞への分化
　　5.6.2　iPS細胞から誘導した抗原特異的T細胞
　　5.6.3　オンフィーダー培養法
　　5.6.4　フィーダーフリー培養法
　　5.6.5　ATO（Artificial Thymic Organoids）法

第6章　幹細胞培養（再生医療）
　6.1　ヒト多能性幹細胞の培養
　　6.1.1　ヒト多能性幹細胞の培養方法
　　6.1.2　ヒト多能性幹細胞の培養に適した培地・因子
　　6.1.3　多能性幹細胞培養の使用場面
　　6.1.4　多能性幹細胞培養でよく起こるトラブル237
　　6.1.5　多能性幹細胞の培養における諸課題
　6.2　ヒトiPS細胞の誘導と樹立
　　6.2.1　単核球分離用採血管を用いた末梢血からの単核球の分離と前培養
　　6.2.2　初期化因子の導入と遺伝子導入細胞の培養
　　6.2.3　iPS細胞コロニーのピックアップ
　6.3　疾患特異的iPS細胞の利用とバンキング
　　6.3.1　疾患特異的iPS細胞
　　6.3.2　疾患特異的iPS細胞の特性解析
　　6.3.3　ゲノム編集などの遺伝子改変iPS細胞
　　6.3.4　疾患特異的iPS細胞のバンキング
　　6.3.5　疾患特異的iPS細胞利用の諸課題と今後
　6.4　神経幹細胞の培養と分化
　　6.4.1　多能性幹細胞からの神経幹細胞の分化
　　6.4.2　神経幹細胞の自己複製
　　6.4.3　神経幹細胞からの神経系分化
　　6.4.4　培養神経（幹）細胞を用いた再生医療
　　6.4.5　培養神経（幹）細胞を用いた研究例
　6.5　神経堤細胞の培養と分化
　　6.5.1　多能性幹細胞から神経堤細胞への分化
　　6.5.2　神経堤細胞の蛍光活性化セルソーター（FACS）による分取
　　6.5.3　神経堤細胞の拡大培養
　　6.5.4　拡大培養した神経堤細胞の凍結融解法
　　6.5.5　神経堤細胞の神経系細胞への分化
　　6.5.6　神経堤細胞の間葉系幹細胞への分化
　　6.5.7　FACSによる間葉系幹細胞への分化の確認法
　　6.5.8　間葉系幹細胞の凍結融解法
　6.6　眼科系細胞の培養と分化
　　6.6.1　多能性幹細胞からの眼科系細胞の分化
　　6.6.2　網膜色素上皮細胞の培養と分化
　　6.6.3　視細胞の培養と分化
　　6.6.4　培養眼科系細胞を用いた研究例
　　6.6.5　培養眼科系細胞を用いた再生医療
　　6.6.6　今後の展望
　6.7　毛包（幹）細胞の培養と分化
　　6.7.1　毛包の発生と毛周期
　　6.7.2　毛包幹細胞と維持・分化機構
　　6.7.3　毛包幹細胞の培養法
　　6.7.4　毛包および皮膚器官系の再構築
　　6.7.5　培養毛包幹細胞研究の展望
　6.8　生殖幹細胞（始原生殖細胞）の培養と分化
　　6.8.1　はじめに
　　6.8.2　始原生殖細胞培養の黎明期
　　6.8.3　始原生殖細胞の発生機構の解明への遺伝学的アプローチ
　　6.8.4　マウスエピブラストからのロバストな始原生殖細胞の誘導
　　6.8.5　マウス多能性幹細胞からの始原生殖細胞の誘導
　　6.8.6　生殖器官オルガノイドによるマウス多能性幹細胞から配偶子への分化培養
　　6.8.7　単独培養系による始原生殖細胞の増殖・分化
　　6.8.8　ヒト多能性幹細胞からの始原生殖細胞の誘導
　　6.8.9　ヒト多能性幹細胞を用いた分化誘導系で見えてくるヒト始原生殖細胞の発生機構
　　6.8.10　ヒトPGCLCsからの配偶子への分化培養
　6.9　胎盤幹細胞の培養と分化
　　6.9.1　ヒトTS細胞の樹立方法
　　6.9.2　ヒトTS細胞の分化誘導
　　6.9.3　ヒトTS細胞の特性
　　6.9.4　ヒトTS細胞の応用展望
　6.10　間葉系幹細胞の培養と分化
　　6.10.1　間葉系幹細胞の培養
　　6.10.2　間葉系幹細胞の分化

第7章　各種臓器からの細胞の培養法
　7.1　神経細胞・神経膠細胞の培養法
　　7.1.1　初代培養神経細胞の培養方法
　　7.1.2　初代培養神経膠細胞の培養方法
　7.2　気管支上皮細胞培養法
　　7.2.1　HBECの初代細胞培養法
　　7.2.2　HBECの気液界面培養法（ALI培養法）296
　　7.2.3　ALI培養法の利用
　7.3　肝細胞培養法
　　7.3.1　マウス肝細胞の分離と培養
　　7.3.2　肝前駆細胞（小型肝細胞）の分離と培養299
　　7.3.3　ラット小型肝細胞の分離と培養
　7.4　腎細胞培養法
　　7.4.1　尿細管単離，初代細胞の樹立
　　7.4.2　不死化細胞の樹立
　7.5　膵ランゲルハンス島細胞培養法
　　7.5.1　ヒト膵ランゲルハンス島の分離法
　　7.5.2　研究での使用を目的としたヒト膵ランゲルハンス島の培養法
　　7.5.3　臨床での移植を目的としたヒト膵ランゲルハンス島の培養法
　　7.5.4　臨床での移植を目的としたヒト膵ランゲルハンス島の低温保存
　　7.5.5　ヒト膵ランゲルハンス島の培養技術の改変
　7.6　消化管上皮細胞培養法
　　7.6.1　オルガノイド培養
　　7.6.2　オルガノイド樹立プロトコール
　　7.6.3　オルガノイド培養・継代プロトコール
　　7.6.4　オルガノイド凍結保存プロトコール
　　7.6.5　オルガノイド解凍プロトコール
　7.7　子宮頸部組織上皮細胞培養法
　　7.7.1　子宮頸部上皮について
　　7.7.2　予備細胞の性状とその同定
　　7.7.3　組織片培養法
　7.8　血管内皮細胞培養法
　　7.8.1　OP9 細胞の維持および共培養系の準備
　　7.8.2　肝臓からの単細胞懸濁液の調製
　　7.8.3　FACSを用いた血管内皮細胞の分離と培養
　7.9　ヒト表皮角化細胞の培養法
　　7.9.1　ヒト表皮角化細胞
　　7.9.2　皮膚採取と細胞単離
　　7.9.3　ヒト表皮角化細胞の培養
　　7.9.4　培養法の展開
　7.10　末梢血細胞の培養法
　　7.10.1　末梢血細胞の分離
　　7.10.2　PBMCの培養
　7.11　筋肉細胞培養法
　　7.11.1　骨格筋線維の単離と培養方法
　7.12　滑膜幹細胞の培養
　　7.12.1　滑膜の採取
　　7.12.2　間葉系幹細胞のウイルス感染
　　7.12.3　培養密度
　　7.12.4　細胞移植
　7.13　脂肪細胞の培養

第8章　細胞の改変・制御方法
　8.1　遺伝子機能の解析方法
　　8.1.1　遺伝子機能解析
　　8.1.2　遺伝子導入法
　　8.1.3　染色体・ゲノム解析
　　8.1.4　mRNA発現解析
　　8.1.5　タンパク質の機能解析
　　8.1.6　カルタヘナ法
　　8.1.7　ポストゲノム時代の細胞培養研究
　　8.1.8　モノクローナル抗体の作製
　　8.1.9　共焦点顕微鏡を使用した解析
　8.2　ウイルスベクターによる遺伝子導入法
　　8.2.1　レンチウイルスを用いた遺伝子導入法
　　8.2.2　アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入法
　8.3　遺伝子改変マウスを用いた初代培養神経細胞の培養
　　8.3.1　初代培養神経細胞の調整
　　8.3.2　試薬などの調整
　　8.3.3　マウス胎仔脳からの海馬神経細胞の調整
　8.4　ゲノム編集の現在（総論）
　　8.4.1　総論
　　8.4.2　ES/iPS細胞でのゲノム編集
　　8.4.3　マウス受精胚への応用
　8.5　DNA・RNAを利用した細胞制御法
　　8.5.1　RNAi（RNA interference：RNA干渉法）
　　8.5.2　ダイレクト・リプログラミングによる心筋誘導法
　　8.5.3　RNAスイッチによる細胞制御法

付　録
　1．細胞培養実験における統計学的処理法
　2．汎用される基礎培地の組成
　3．培養用試薬溶液類の組成
　4．細胞培養実験における実験記録の作成法
　5．細胞培養実験に関する法令・指針類

資料編